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本制品是百奥莱博公司开发的专门用于哺乳动物组织、细胞等样本中的Caspase-3活性研究检测的试剂盒。

Caspase是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含10多个成员。Caspase-3是凋亡过程中最主要的终末蛋白酶，也是研究最多caspase；它激活pro-caspase-2、6、7、9特异水解多种关键凋亡蛋白如PARP，介导染色质固缩、凋亡小体生成、核DNA断裂。

基于Caspase-3特异水解多肽底物DEVD-pNA (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)，释放的游离硝基苯胺pNA在405nm有最大吸收峰。采用可见光光度比色法测定pNA而得到Caspase活性。

• 试剂一：分装-20℃保存。
  
• 试剂二：分装-20℃保存。
  
• 标准品：pNA标准溶液，5mmol/L。标准溶液在4℃条件下为浑浊状态，溶解即可变为澄清状态，不影响使用。
  
• 标准品稀释液配制：取9mL试剂一加入1mL试剂二，充分混匀待用。
  
  • 也可按照试剂一∶试剂二＝9∶1的比例，自行配制。

• 实验之前建议选择2～3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
  
• 由于试剂二中含有还原剂（DTT），建议将样品用水稀释2倍后，用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用BCA法测定蛋白浓度。
  
• Caspase活性测定值低最常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测最佳的观察点。
  
• 所测样本的值高于标准曲线上限时，可用试剂二稀释样本后重新测定。
  
• 盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37℃孵育，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。

• 样本处理：
  
  • 培养细胞：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（约10⁶个）加100μL试剂二（若裂解不充分可提高至150～200μL），震荡重悬沉淀，置冰上静置15min，4℃，15000g离心10～15min，取上清置冰上待测。
    
  • 组织：按照组织质量(g)∶试剂二(mL)＝1∶5～10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置15min，4℃，15000g离心10～15min，取上清置冰上待测。
• 测定步骤：
  
  • 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。
    
  • 临用前用标准品稀释液将5mmol/L pNA标准品稀释至200、100、50、25、12.5、0 μmol/L的标准溶液待用。
    
  • 在96孔板/EP管中按顺序加入以下试剂
    

    成分(μL)	测定管	空白管	标准管
    试剂一	40	40
    样本	50
    试剂二		50
    试剂三	10	10
    标准溶液			100

  • 立即测定标准管405nm下吸光度。
    
  • 混匀，盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37℃孵育60～120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定405nm处吸光值。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。空白管只需做1～2次。计算ΔA _测定＝A _测定管－A _空白管。
• Caspase-3活性计算：
  
  • 标准曲线的建立：
    根据标准管的浓度（x，μmol/L）和ΔA标准（y，减去浓度为0的空白管）做标准方程。将ΔA测定代入标准方程得到x（μmol/L）。
    
  • 按酶活性增加百分比计算：
    Caspase-3活性增加百分比=（实验处理组A_测定-A_空白管）/（实验对照组A_测定-A_空白管）×100%
    该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
    
  • 按酶活计算：
    参考Chemicon公司的caspase酶活力单位的定义：一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol pNA底物产生1nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase酶活性。
    Caspase-3活性（U/mg prot）=x×V_反总÷(V_样×Cpr)÷T×10³=2x÷Cpr÷T
    V_反总：反应体系总体积，0.1mL=10^-4L；
    V_样：加入的样本体积，0.05mL；
    T：反应时间，h；
    Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
    10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。